组织细胞培养基

【原理】

  Zinsser、Fitzpatrick及魏曦于1939年用琼脂斜面组织培养法培养立克次体后，该法（或其改良法)曾为立克次体实验室所常用。1954年开始以胰蛋白酶消化组织建立单层细胞培养和空斑技术培养病毒获得成功以来，因其有方法简便、便于观察及容易纯化等特点，而迅速应用于立克次体的研究，目前已代替了原先固定或悬浮的组织块培养法。

【成分】

  1.原代细胞：原代细胞得自新杀死的动物，手术摘除的器官、鸡胚，流产或手术取出的胚胎，以及正常分娩的胎盘羊膜等。鼠胎、豚鼠及乳兔的肾和睾丸，其它如猴肾、人羊膜等细胞亦可使立克次体繁殖良好。一些由正常和肿瘤组织获得的传代细胞株如 HeLa细胞（人子宫颈癌上皮细胞),Detroit-6 细胞(骨髓上皮样细胞),Vero细胞(非洲绿猴肾上皮细胞)，鼠纤维母细胞L株、14pf株、L929株、鼠淋巴母细胞MBIII株等，均能供立克次体很好生长繁殖。

  2.合成培养基：199培养液等。

【制法】

  1. 原代细胞：各种细胞的制备法基本相似。以常用的鸡胚细胞为例,其制备步骤如下：选无特异病原的鸡卵孵育9~11天，取出鸡胚剪去头、爪和内脏，将余下组织剪碎并以Hanks液洗净，加0.25%胰蛋白酶液，置37℃搅拌消化20~30分钟，用滴管反复吹打使细胞分散，经四层纱过滤，低速离心沉淀1次，弃上清，沉淀的细胞加适量生长液稀释计数,使每毫升含50万细胞，移种到试管或链霉素瓶中(为观察立克次体形态或繁殖动态，内放6~9X18~22(mm)的小盖片），静置培养在36~37℃孵箱，于48~72小时内即长成单层细胞。

  2.次代细胞：单层细胞一般较原代细胞长得均匀，按Wisseman等(1974)的方法，将以常规法制备的原代鸡胚细胞置32~34℃孵育5天后，倒去生长液，用胰蛋白酶消化，吹打使细跑分散，低速离心，沉淀细胞加生长液重新悬浮并计数，或经3000拉德的X线照射后稀释至每毫升含10万细胞，分装培养后，备用。

  3.传代细胞：倒去生长液，用Hanks液洗1次，加入0.25%胰蛋白酶或0.02%Versene(乙二胺四乙酸二钠，EDTA)溶液，置37℃孵箱1~5分钟，翻转细胞瓶，继续孵育5~10分钟，弃去消化液，加适量生长液，使细胞分散，计数(若为细胞传代可不计数，一般以一瓶传2~4瓶),分装培养。

  4.培养基:一般常用合成培养基，如199(几乎包含所有的氨基酸和维生素，一些核酸的水解产物，以及辅助生长因子，用 Hanks或Eagle平衡盐溶液配制)、Eagle量低限度必要成分培养基(MEM，含最适浓度的哺乳类细胞生长必不可少的氨基酸和维生素，有些细胞需加强用4倍含量的氨基酸和维生素)，以及Leibovitz15(L-15)培养基(用半乳糖代替葡萄糖，并有过量的氨基酸)。这些培养基常用Hepes(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2'-ethane-sulphonic acid)缓冲液以维持pH的恒定。作为生长液，还必须加10%的小牛血清（经过56℃加热30分钟)。天然材料如0. 25%~0.5%的乳白蛋白水解物加一定量的小牛血清也广泛地应用于各种细胞的培养。每毫升生长液加青霉素100U，链霉素100μg，或再加其它抗生素。维持液中减少小牛血清含量，也不加抗生素。

【用途】

  培养增殖立克次体。

  1.试管或培养瓶法：取已长成单层的细胞培养管(瓶)，吸去生长液，洗涤后加入适当浓度的立克次体悬液，室温或35℃静置15分钟至2小时，或室温低速离心10~15分钟，吸去剩余的感染材料，加入新鲜生长液或维持液，置32~35℃孵育。如有盖片可在培养后取出染色镜检。

  2.玻片培养法（Wisseman等，1974)：供培养用的玻片或塑料板常具8个平底培养小室。将制备好的细胞悬液加入每小室内各0.3ml,置塑料盒内，在32~34℃含5%CO2大气中培养24小时，吸去原生长液，加0.3ml立克次体悬液于每小室内（可用不同的浓度），在32~34℃下经2小时后，吸去接种材料，冲洗后加入新鲜生长液各0.3ml，置同样条件下培养。检查时可将培养玻片染色镜检，观察感染细胞的百分率，每一个小室中100个细胞内含有立克次体数，有利于研究立克次体的生长动力学，与宿主细胞相互关系及抗立克次体药物的作用等。

【注意事项】

  1.细胞的选择性与细胞病变：立克次体对细胞的选择性一般并不严格，但它们在不同细胞中繁殖和感染的程度可能有差异。除斑点热群及Q热立克次体的某些株外，在单层细胞中立克次体常不引起明显的细胞病变。如恙虫病立克次体与立氏立克次体在同样条件下培养于14pf株细胞，前者虽繁殖量较大，但细胞无可见的病变现象；而后者在细胞内的数量并不多，却有明显的细胞退行性变。但是，Barker等(1968)用BS-C-1细胞(传代猴肾细胞系)培养恙虫病立克次体证明，这种细胞感染后能发生明显的细胞肿胀、变圆，也可有细胞皱缩、胞核浓缩及胞浆颗粒样变性等。据国内资料，我国的恙虫病立克次体株在鸡胚、兔睾丸、兔肾、地鼠肾等细胞培养中不发生显著病变。

  2.接种量与吸附方式：立克次体接种量的大小对以后在细胞内生长的影响报告不一。恙虫病立克次体接种量少，获得丰富繁殖或致细胞病变作用所需时间长，而Q热立克次体的鸡胚细胞培养接种量虽相差25倍，但培养后开始出现立克次体的时间及其繁殖量并无明显区别。接种量大小可能不如接种物所处的生长期不同对立克次体繁殖的影响重要。用对数生长期的普氏立克次体接种，不像处于稳定期的接种物那样接种后有生长迟缓期，可很快进入旺盛的繁殖。

  3.细胞培养中的支原体污染：细胞培养物污染支原体甚为普遍，特别在连续传代的细胞更为常见，原代细胞出现较少。其污染与加抗生素及牛血清有关，实验室工作人员的鼻、口咽及手亦为重要来源。由于支原体在繁殖过程中消耗培养基中细胞赖以生存的必要氨基酸，特别是精氨酸，从而引起细胞退行性变化，使立克次体繁殖或其它研究无法进行。为预防支原体的污染，必须在细胞培养过程中严格无菌操作。加入培养基的血清经56℃或60℃加热半小时对控制支原体污染有效。卡那霉素也可成功地清除污染的支原体。

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